Vai diễn đầu tiên của Smulders là khách mời trong bộ phim viễn tưởng khoa học Jeremiah và xuất hiện trong nhiều chương trình truyền hình khác như The L Word. Vai diễn cố định lâu dài đầu tiên của cô là ở bộ phim Veritas: The Quest chỉ kéo dài một phần.

Sau khi Veritas bị ngưng chiếu, Smulders được tuyển vai một biên tập viên truyền hình, Robin Scherbatsky trong loạt phim phim hài How I Met Your Mother vào năm 2005 và tiếp tục diễn cho đến hết 9 phần của bộ phim.

Trên sân khấu New York, cô trình diễn vở Love, Loss, and What I Wore từ 10 tháng 6 đến 27 tháng 6 năm 2010.[6]

Smulders thể hiện vai Maria Hill trong bộ phim năm 2012 của Joss Whedon mang tên The Avengers. Cô tiếp tục vai diễn này trong buổi công chiếu phiên bản bộ phim truyền hình - Marvel's Agents of S.H.I.E.L.D.[7] và một lần nữa trong bộ phim Captain America 2: Chiến binh mùa đông năm 2014, trước khi được thông báo tiếp tục vai diễn này lần nữa trong Avengers: Age of Ultron vào năm 2015.[8][9] Whedon từng đề nghị đưa cô vai diễn Wonder Woman trong bản nháp của bộ phim cùng tên, nhưng không được đưa vào sản xuất.[10] Thay vào đó, Smulders đã được lồng tiếng cho nhân vật Wonder Woman phiên bản Lego trong bộ phim hoạt hình đầu năm 2014 - The Lego Movie.

Năm 2013, Smulders có tham gia vai phụ trong bộ phim tình cảm Safe Haven. Cô cũng tham gia đóng vai trong bộ phim hài Delivery Man của Vince Vaughn ngay trong năm đó.[11]